細胞計數是細胞培養過程中的重要步驟,“傳統的細胞計數方法"是在顯微鏡下使用血細胞計數板人工計數。這里博大博聚為大家介紹下傳統細胞計數的詳細的步驟,供大家參考。
1、準備好血細胞(bao)計數板
1) 先用無水乙醇清潔血細胞計數板表面和蓋玻片;
2) 再用純水清潔血細胞計數板表面和蓋玻片;
3) 每次清洗后用洗耳球吹干。
4) 在血細胞計數板的計數池上方蓋上專用的蓋玻片。
注意:最好不要擦拭血細胞計數板的計數池(chi),防止標識線損壞。
2、制備細胞懸(xuan)液
1) 貼壁生長的細胞,使(shi)用(yong)胰酶消化(hua)的方法使(shi)細胞從培養瓶表面脫落;
2) 漩渦混勻或使用移液器反復吹吸細胞懸液,盡量減少細胞團簇;
3) 懸(xuan)浮細胞則可以直接進行取樣計數;
4) 細胞懸液濃度控制在1×106個細胞/mL左右。
注意:
a) 盡量少、盡量小的細胞團簇;
b) 如需計算活率,則需將細胞懸液按照1:1的比例加入等量的0.4%的臺盼藍染料,混勻后,靜置1~2分鐘。
3、細胞加(jia)樣
1) 移液器輕吹細胞懸液使其混合均勻;
2) 將細胞懸液與臺盼藍染料按1:1體積混合均勻;
3) 取出10uL細胞懸液,將細胞懸液滴加于血細胞計數板邊緣凹槽處,此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池。
注(zhu)意:
1) 每次加樣前要混勻細胞懸液,防止細胞沉降造成取樣誤差增大;
2) 加樣過程中,要一次性將細胞懸液注入計數室,防止氣泡產生,否則要重做;
3) 加樣時不要將細胞懸液直接吹入計數池,會造成細胞分布不均勻。
4、 人工細(xi)胞計數
計數(shu)工(gong)具:10X物鏡(jing)的顯微鏡(jing)、血細胞計數(shu)板。
1) 加樣后,將血細胞計數板靜置數分鐘;
2) 把血細胞計數板放置在顯微鏡的載物臺進行觀察-計數-記錄;
3) 分別計數大方格1-2-3-4中的細胞總數。
注意:
1) 計數時建議重復1-2次,取平均值,減小計數誤差;
2) 四個區域的細胞數量偏差不應超過 5%,否則要重新加樣。
3) 對橫跨刻度上的細胞,依照“數上不數下,數左不數右"的原則進行計數。
4) 為降低細胞計數誤差,濃度最好控制在1×106個細胞/mL左右;
5) 計數時,只計數完整的細胞,如有聚團細胞則按一個細胞進行計數。
5、 血細胞計數(shu)板濃(nong)度計數(shu)標(biao)準
(中(zhong)國的(de)標(biao)準(zhun):JJG 552-1988血細胞(bao)計數板試(shi)行檢定規程(cheng))
1) 如上圖所示,當血細胞計數板放上蓋玻片后,平臺與蓋玻片之間的距離 (即高度)為 0.1mm;
2) 平臺中心部分各以3mm長,3mm寬精確劃分為9個大方格,稱為計數室,每個大方格面積為1mm2,體積為 0.1mm3;
3) 細胞濃度 (mL)=(四個大方格細胞數之和)/4X2(染液稀釋倍數)X 104=?個細胞/mL。
注意:如果(guo)不加入(ru)臺(tai)盼藍(lan)染料,則無需乘以2。
相信(xin)有(you)些小伙伴,即使(shi)花費(fei)很長(chang)時間熟悉(xi),并實際接(jie)觸細胞計數(shu)操作的全部流程后,還是(shi)會有(you)結(jie)果(guo)不滿意、人工操作效率低(di)、結(jie)果(guo)無法一目了(le)然、細胞計數(shu)數(shu)到“眼疼"的情況(kuang)。
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7、血細胞計數板上機(ji)實拍圖案(an)例
8、細胞計(ji)數結果包括
總(zong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)濃度(du)、活/死(si)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)濃度(du)、活/死(si)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)比率、總(zong)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)聚團率/濃度(du)、活細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)聚團率/濃度(du)、死(si)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)聚團率/濃度(du)等(deng)(deng)計數(shu)結果、原始圖(tu)片(pian)、識別圖(tu)片(pian)、柱狀圖(tu)、散點圖(tu)、等(deng)(deng)高線圖(tu)、報告單等(deng)(deng)…
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